2019년 정밀의료기술개발사업단 연구 프로젝트 소개

 연구주제

 한국인 대장암 유전체에서 MMR 유전자의 결손과 Long-repeat의 길이 변화분석 연구 

 연구책임자

 강성범(분당서울대병원)/ 김태유

 핵심연구원

 이세준(분당서울대병원)

 작성자

 이세준

1) 연구배경

 암유전체에서의 차세대염기서열분석은 100-150 bp 의 짧은 read를 대량 생산하는 방식으로 SNV, INDEL, CNV의 정확한 검출을 목표로 합니다. Microsatellite와 같은 반복적인 염기서열의 검출도 항암치료를 위한 유용한 마커로 활용될 수 있기 때문에 활발히 이루어지고 있지만 10-60bp의 짧은 반복서열에 대한 연구가 대부분입니다. 상대적으로 암 유전체에서의 긴 반복서열의 동정은 활발히 이루어지지 않고 있습니다. 그 이유는 짧은 read (100-150bp)로 인해 이보다 긴 반복 DNA염기서열을 동정하기 어렵기 때문입니다. 하지만, long-read 시퀀싱은 4Kbp – 8Kbp 길이의 시퀀스를 연속적으로 읽을 수 있기 때문에 긴 반복서열의 길이를 정확하게 측정 가능합니다.

2) 생식세포 반복 DNA염기서열 동정

 반복 염기서열은 박테리아에서 포유동물까지 광범위한 종에 풍부하며, 인간 게놈의 거의 절반을 차지한다고 알려져 있습니다. 차세대염기서열기술(NGS)이 개발은 이러한 반복 염기서열에 대한 유전체 전체 수준의 분석을 가능하게 하였습니다. [Gymrek M et al., 2012, Genome Research; Thomas W et al., 2017, Nature Methods] 짧은 반복DNA염기서열, 예를 들면 Short Tandem Repeats (STR), 은 특히 가장 다형성이 높은 유전체 마커로 알려져 있기 때문에 주로 DNA Forensic 에서도 많은 활용이 이루어지고 있습니다. 또한 유전병 중에는 STR의 길이가 매우 길어지면서 생기는 병들 (Fragile-X, Huntington's disease) 이 잘 알려져 있고, 최근 이와 관련된 STR 마커들을 생식세포의 차세대염기서열 데이터에서 찾아보려는 시도들이 늘어나고 있습니다. 이러한 유전적인 STR 변이들은 그 길이가 200-1000bp로 길기 때문에, 100-150bp의 짧은 서열 기반인 차세대염기서열분석기술로는 검출이 어려운 도전적인 문제입니다.

3) 체세포 특이 반복 염기서열 동정 및 기존 연구 한계점

 체세포에서의 반복 염기서열 동정은 암 진단 및 예후 예측과 밀접한 관련이 있습니다. 현미부수체(Microsatellite)는 가장 짧은 STR 그룹이며, 1-6bp 의 단위의 염기서열이 반복되는 염기서열입니다. 현미부수체 불안정성(Mircrosatellite instability, MSI)은 DNA mismatch repair 메커니즘이 망가졌을 경우 Microsatellite 의 전체 길이가 짧아지거나 늘어나거나 하는 현상이며, 대장암과 위암, 그리고 자궁내막암에서 빈번하게 발생하는 현상입니다. MSI중 생식세포에서 DNA mismatch repair 메커니즘이 망가졌을 경우를 Lynch syndrome이라고 부르며 암을 일으키는 원인 중 하나로 알려져 있습니다. 일반적으로 대장암, 위암, 자궁내막암의 경우 15-25% 정도의 환자들이 체세포에서만 MSI-high 현상을 가지고 있습니다. MSI-high 인 환자인 경우 비교적 예후가 좋은 것으로 알려져 있고, hypermutated type으로 알려져 있습니다. 최근, hypermutated tumor 환자인 경우 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor)가 효과적인 반응군으로 보고되고 있어, MSI-high 검출의 중요성이 더 증가하고 있습니다.

 현재 차세대염기서열분석기반의 체세포 반복 염기서열 돌연변이 감지는, 차세대염기서열분석의 특성인 짧은(100-150bp) 염기서열 시퀀싱의 한계로 인해 현미부수체 (Microsatellite)의 반복 수준에 제한되어 연구가 진행되고 있습니다. 특히 현미부수체의 경우도 대부분의 동정 기술은 mono-nucleotide 길이 검출에 집중하고 있습니다. 이는 암의 예후와 관련되어 있다고 알려진 Microsatellite Instability-High (MSI-H)를 측정하는데 있어, Mono-nucleotide의 길이 불안정성이 주요 마커이기 때문입니다. 또한 4-6bp 단위 염기서열의 반복은 현재의 alignment 방식에서 mapping이 안될 가능성이 높아 unmapped read의 분석을 필요로 합니다. 이러한 long-MS 반복을 정확한 동정을 할 수 있다면, 예후와 관련된 새로운 마커를 찾을 수 있을 것입니다. 예를 들면, EMAST(Elevated Microsatellite Alterations at selected tetranucleotide repeats)는 마커가 존재하는 경우에 환자의 예후가 좋지 않다는 보고가 있습니다. 그리고 더 긴 반복서열인 Minisatellite 반복 길이 불안정성도 프로모터 지역에서 텔로미어 역전사 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있다는 보고가 있습니다. 이처럼, 긴 반복 염기서열의 유전체 수준의 동정을 통해 아직 밝혀지지 않은 암 유전체 마커의 발굴 가능성을 높일 수 있을 것이라 기대됩니다

4) 기존 연구와 차별화

 앞서 소개한 MMRD현상과 관련된 짧은 체세포 반복 변이의 경우, 최근 전체 암종에서 변이를 검출하여 분석을 진행한 논문들이 High-profile 저널에 게재 되고 있습니다. [Isidro C & Sejoon L et al., 2017, Nature communications; Ronald J et al., 2016, Nature Medicine; Yosef E et al., 2017, Nature Biotechnology] 그러나, 체세포에 존재하는 긴 반복 염기서열의 분석은 짧은 read(100-150bp)의 NGS의 특성으로 인해 현재 거의 이루어지지 못하고 있습니다. 이를 극복하기 위하여 Long-read 시퀀싱을 통해 긴 반복 염기서열을 분석할 수 있게 된다면 MMRD현상이 암 유전체에서 짧은 반복서열과 긴 반복서열의 길이변화와 어떤 관계가 있는지 살펴볼 수 있을 것이며, 암유전체에서의 MMRD로 인한 반복서열 길이변화 지도를 좀 더 정확하게 작성할 수 있을 것입니다.

 대장암은 MMRD 현상이 15% 정도 (sporadic case)에서 발견되며 전체 암종 중에서는 자궁내막암 다음으로 MMRD가 빈번하게 일어나는 암종입니다. MMRD 또는 MSI-High 검체에서 Long-read 시퀀싱을 진행할 수 있다면 MMRD에 영향을 받는 긴 반복서열에 대한 reference를 구축할 수 있을 것이며 대장암에서의 새로운 마커 발굴에 활용할 수 있을 것입니다.